冷凍保存細(xì)胞之方法？
冷凍保存方法一: 冷凍管置于4℃ 30~60 分鐘→ （-20 ℃30 分鐘*） → -80 ℃16~18 小時(shí)（或隔夜） → 液氮槽vaporphase 長(zhǎng)期儲(chǔ)存。
冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機(jī)中每分鐘降1-3 ℃ 至–80 ℃ 以下， 再放入液氮槽vapor phase長(zhǎng)期儲(chǔ)存。*-20 ℃不可超過(guò)1 小時(shí)， 以防止冰晶過(guò)大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過(guò)此步驟直接放入-80℃ 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

產(chǎn)品屬性：

名稱    大鼠椎間盤(pán)髓核細(xì)胞
2.組織來(lái)源：椎間盤(pán)組織

3.產(chǎn)品規(guī)格：5×105cells/T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶

4.細(xì)胞簡(jiǎn)介：

大鼠椎間盤(pán)髓核細(xì)胞分離椎間盤(pán)組織；椎間盤(pán)是位于脊柱兩椎體之間，分為中央部的髓核，富于彈性的膠狀物質(zhì)；周?chē)康睦w維環(huán)，由多層纖維軟骨環(huán)按同心圓排列。上下有軟骨板，是透明軟骨復(fù)蓋于椎體上，下面骺環(huán)中間的骨面。上下的軟骨板與纖維環(huán)一起將髓核密封起來(lái)。纖維環(huán)由膠原纖維束的纖維軟骨構(gòu)成，位于髓核的四周。纖維環(huán)的纖維束相互斜行交叉重疊，使纖維環(huán)成為堅(jiān)實(shí)的組織，能承受較大的彎曲和扭轉(zhuǎn)負(fù)荷。髓核，是乳白色半透明膠狀體，富于彈性，為椎間盤(pán)結(jié)構(gòu)的一部分，位于兩軟骨板與纖維環(huán)之間。由縱橫交錯(cuò)的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)即軟骨細(xì)胞和蛋白多糖黏液樣基質(zhì)構(gòu)成的彈性膠凍物質(zhì)。嬰幼兒時(shí)期的髓核含水量為80%-90%，即使到了老年，其含水量也在70%上下。髓核在出生時(shí)體積大而松散，位于椎間盤(pán)的中央，至成年時(shí)位置移至椎間盤(pán)的中后部；在成年以前構(gòu)成髓核的主要物質(zhì)是大量蛋白多糖復(fù)合體、膠原纖維和纖維軟骨，隨著年齡的增長(zhǎng)，髓核中的蛋白多糖解聚增多，水分逐漸減少，膠原增粗并逐漸被纖維軟骨所替代。

5.方法簡(jiǎn)介：

公司實(shí)驗(yàn)室分離的大鼠椎間盤(pán)髓核細(xì)胞采用膠原酶-中性混合消化法并結(jié)合軟骨細(xì)胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選制備而來(lái)，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶。

6.質(zhì)量檢測(cè)：

公司實(shí)驗(yàn)室分離的大鼠椎間盤(pán)髓核細(xì)胞經(jīng)Ⅱ型膠原蛋白免疫熒光鑒定，純度可達(dá)90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌等。

7.培養(yǎng)信息：

培養(yǎng)基 含FBS、生長(zhǎng)添加劑、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率 每3-4天換液一次

生長(zhǎng)特性 貼壁

細(xì)胞形態(tài) 梭形、多角形

傳代特性 可傳5代左右；3代以內(nèi)狀態(tài)佳

消化液 0.25%

培養(yǎng)條件 氣相：空氣，95%；CO2，5%

培養(yǎng)操作：
1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有 1mL 細(xì)胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，加 入 4mL 培養(yǎng)基混合均 勻。在 1000RPM 條件下離心 4 分鐘，棄去上清液，補(bǔ) 加 1-2mL 培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培 養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)?/span> 細(xì)胞懸液加入 10cm 皿中，加入約 8ml 培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜）。第二天換液并 檢查細(xì)胞密度。
2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá) 80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的 PBS 潤(rùn)洗細(xì)胞 1-2 次。
2. 加 1ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于 37℃培 養(yǎng)箱中消化 1-2 分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分 變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng) 瓶后加少量培養(yǎng)基終止消 化。
3. 按 6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在 1000RPM 條件下離心 4 分 鐘，棄去上清液，補(bǔ)加 1-2mL 培養(yǎng)液后吹勻。
4. 將細(xì)胞懸液按 1：2 比例分到新的含 8ml 培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3）細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面 T25 瓶為類；
1. 細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后，PBS 清洗一遍后加入 1ml ，細(xì)胞變圓 脫 落后，加入 1ml 含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。
2. 4 min 1000rpm 離心去掉上清。加 1ml 血清重懸細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加 入血 清和 DMSO，輕輕混勻，DMSO 終濃度為 10%，細(xì)胞密度不低于1x106/ml，每支凍存管凍存 1ml 細(xì)胞懸液，注意凍 存管做好標(biāo)識(shí)。
3. 將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80 度冰箱，2 個(gè)小時(shí)以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
釀酒酵母   蟲(chóng)草

刺孢吸水鏈霉菌北京變種   伊氏李斯特氏菌

凸圓靈芝(白芝)   藤黃微球菌

改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基70mm   淡紫青霉

產(chǎn)氣莢膜梭菌   阿爾萊特葡萄球菌
大鼠印度刺猬因子(IHH)elisa檢測(cè)試劑盒

大鼠音猬因子(SHH)elisa檢測(cè)試劑盒

大鼠抑制素βE(INHβE)elisa檢測(cè)試劑盒

大鼠抑制素βC(INHβC)elisa檢測(cè)試劑盒

大鼠抑制素βA(INHβA)elisa檢測(cè)試劑盒
大鼠椎間盤(pán)髓核細(xì)胞人肝素輔因子Ⅱ(HCⅡ)elisa分析檢測(cè)試劑盒

人肝素輔因子Ⅱ(HCⅡ)elisa檢測(cè)試劑盒免費(fèi)代測(cè)

人肝素輔因子II-凝血酶(HCII-T)復(fù)合物elisa分析檢測(cè)試劑盒

人肝素輔因子II-凝血酶(HCII-T)復(fù)合物elisa檢測(cè)試劑盒

人肝素結(jié)合EGF樣生長(zhǎng)因子(HBEGF)elisa分析檢測(cè)試劑盒
實(shí)驗(yàn)報(bào)告：
產(chǎn)品僅用于科研一、分離與培養(yǎng)：
1、無(wú)菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，后將成1mm3左右大小；
2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；
3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；
4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；
二、免疫熒光鑒定：
1、待心房肌細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；
2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；
3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；
4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過(guò)夜；
5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；
6、用PBS沖洗3次，每次10min，后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。